目的：建立人胎兒視網(wǎng)膜色素上皮（human fetal retinal pigment epithelial， HFRPE）細(xì)胞視網(wǎng)膜下移植在兔視網(wǎng)膜下間隙的三維繁殖系統(tǒng)并評(píng)估其生長(zhǎng)模式。
方法：進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的3切口玻璃體切割術(shù)后，將交叉樣纖維蛋白原上生長(zhǎng)的HFRPE細(xì)胞微球植入兔視網(wǎng)膜下間隙。手術(shù)后7、14及30d應(yīng)用檢眼鏡和光學(xué)顯微鏡對(duì)術(shù)眼進(jìn)行研究。
結(jié)果：7d檢眼鏡檢查在18只眼中11只眼（61%）顯示HFRPE微球周圍有放射狀色素沉著，組織學(xué)檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于宿主視網(wǎng)膜色素上皮上面生長(zhǎng)出單層的HFRPE細(xì)胞。對(duì)照眼中發(fā)現(xiàn)伴有微球周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的脈絡(luò)膜萎縮斑。
結(jié)論：生長(zhǎng)于交叉樣纖維蛋白原上的人胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞能夠成功地移植于視網(wǎng)膜下間隙。細(xì)胞最少能夠存活1個(gè)月并在宿主視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞上面形成單層細(xì)胞，伴有輕微的炎癥反應(yīng)。在炎癥反應(yīng)方面，進(jìn)行移植眼與對(duì)照眼之間的不同可能顯示為HFRPE細(xì)胞在炎癥、免疫或二者均有的調(diào)整作用。這一新的傳代模式可能對(duì)視網(wǎng)膜下移植細(xì)胞生物學(xué)和相關(guān)免疫反應(yīng)具有重要意義。
臨床評(píng)估：這一研究結(jié)果對(duì)于更好地理解視網(wǎng)膜色素上皮移植后的活動(dòng)制可能具有重要意義。文中提出的模型可以進(jìn)一步用于視網(wǎng)膜色素上皮移植領(lǐng)域的臨床和實(shí)驗(yàn)研究。
評(píng)論
視網(wǎng)膜下移植色素上皮細(xì)胞已顯示出了在一些退行變性性視網(wǎng)膜病方面挽救其上感光細(xì)胞的希望24。這對(duì)處理各種影響視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的疾病是很重要的。我們的三維培養(yǎng)系統(tǒng)為供體組織進(jìn)入視網(wǎng)膜下間隙提供了一個(gè)新的途徑。
含有細(xì)胞的HFRPE移植微球進(jìn)入視網(wǎng)膜下間隙是簡(jiǎn)單和可重復(fù)的。供體組織大小和形狀的可調(diào)整性使其容易嵌入視網(wǎng)膜下間隙。因?yàn)樵谖覀兊哪Ｐ椭蠬FRPE形成了一個(gè)緊密的團(tuán)塊，細(xì)胞幾乎沒有反向生長(zhǎng)的可能性7。就我們所知，在以往視網(wǎng)膜色素上皮移植的研究方面沒有供體細(xì)胞向視網(wǎng)膜下間隙增殖或植入的證據(jù)25。有一些研究說明26～28視網(wǎng)膜下間隙是一個(gè)免疫特赦環(huán)境，這里細(xì)胞的增殖受到嚴(yán)密的控制。在這樣的環(huán)境中移植細(xì)胞的旺盛增殖或植入可能需要一些基本類型的剌激。在我們的模型中纖維蛋白原和三維狀態(tài)的HFRPE組織可以促進(jìn)從原植入部位長(zhǎng)出的細(xì)胞活力。我們實(shí)驗(yàn)室近來的研究提供了關(guān)于支持視網(wǎng)膜間隙對(duì)細(xì)胞活性調(diào)節(jié)作用的間接重要證據(jù)。與纖維蛋白基質(zhì)方面的細(xì)胞生長(zhǎng)相比，人類胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞生長(zhǎng)成為微球在人工聚合體基質(zhì)方面顯示了明顯降低視網(wǎng)膜下延伸的可能性29。有些細(xì)胞類型再一次表現(xiàn)出了在三維培養(yǎng)中活性特征和對(duì)細(xì)胞特殊功能的維持，這在單層培養(yǎng)中會(huì)被丟失。三維培養(yǎng)中的細(xì)胞顯示增加了DNA的合成和增殖30，31。對(duì)接受者提供三維培養(yǎng)體系的供體細(xì)胞顯示在宿主組織中延長(zhǎng)了從原部位和自身建立區(qū)域內(nèi)的存活和植入的活力10，11。另外，纖維蛋白原在細(xì)胞的增殖和植入方面是一個(gè)已知的有效剌激32。與其相比，fibronectin是Bruch膜和視網(wǎng)膜色素上皮環(huán)境的重要的成份33。HFRPE細(xì)胞生長(zhǎng)在具有三維結(jié)構(gòu)狀態(tài)的交叉連接纖維蛋白基質(zhì)中，細(xì)胞間為緊密接觸，可能使其變得更為活躍34，35，并且在被帶入視網(wǎng)膜間隙后能使其植入和增生。盡管對(duì)位于其上的視網(wǎng)膜有明顯的損害，但其表現(xiàn)僅為局部的并局限于微球的部位。這一損害在大小上如同一個(gè)激光斑。但是在距微球更遠(yuǎn)處的單層HFRPE上面的視網(wǎng)膜是受保護(hù)的。
在我們的研究中，供體細(xì)胞生長(zhǎng)源外邊的HFRPE細(xì)胞的生長(zhǎng)可能為在中心凹外緣移植微球引起的向中心凹下間隙播散提供一個(gè)機(jī)會(huì)。
無色素兔中經(jīng)檢眼鏡所觀察到的移植微球周圍視網(wǎng)膜下色素沉著組織學(xué)上與單層色素上皮細(xì)胞相對(duì)應(yīng)。在免疫組化方面通過對(duì)HLA-ABC抗體的染色確定移植細(xì)胞，同樣顯示從原植入處形成呈單層長(zhǎng)入靠近植入微球的HFRPE細(xì)胞。與HFRPR移植眼相比，所有植入空白基質(zhì)的對(duì)照眼顯示較為明顯的炎性反應(yīng)，并且淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增加。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)其他細(xì)胞的功能與活動(dòng)，例如淋巴細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，巨噬細(xì)胞36～38。近代研究39已顯示有些呈球形生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞與單層生長(zhǎng)的細(xì)胞相比，增加了對(duì)淋巴細(xì)胞防衛(wèi)的抵抗和對(duì)淋巴細(xì)胞穿透作用的抑制。人胎視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞以一個(gè)多細(xì)胞球樣移植，例如微球狀，可能與對(duì)淋巴細(xì)胞的抑制相類似。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞已被揭示具有釋放免疫抑制作用和抑制新生血管形成的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換因子β家族蛋白的功能41，42。
另外在三維培養(yǎng)系統(tǒng)生長(zhǎng)的細(xì)胞類型顯示出細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)的增加，包括生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換因子43。基質(zhì)上的人胎視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞與對(duì)照眼相比，能預(yù)防其直接與視網(wǎng)膜下組織的接觸所導(dǎo)致的劇烈炎癥。有的研究解釋24健康的供體細(xì)胞釋放對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植具有營救作用的胞質(zhì)。與單層細(xì)胞相比，由于健康細(xì)胞的高度聚積，HFRPE細(xì)胞的三維培養(yǎng)可能是一個(gè)比較好的各種營養(yǎng)胞質(zhì)積累釋放的來源43。
最后一點(diǎn)，以微球形式進(jìn)入視網(wǎng)膜下間隙的供體細(xì)胞的制備是可重復(fù)的，且技術(shù)簡(jiǎn)單，可減少對(duì)視網(wǎng)膜的醫(yī)源性損害。最短1個(gè)月供體細(xì)胞在視網(wǎng)膜下間隙能夠擴(kuò)大和生存。作為三維培養(yǎng)系統(tǒng)的HFRPE細(xì)胞的視網(wǎng)膜下移植可能成為一個(gè)研究供體和宿主細(xì)胞相互作用的有用模型。
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